用细胞因子/细胞毒性™小组流式细胞仪肿瘤渗透淋巴细胞的功能分析

促炎细胞因子响应与CANZYME B和CD107a（灯-1）的表达相结合，是免疫肿瘤间空间中的有价值的生物标志物^1-3。基于细胞的测定，可以量化肿瘤衍生效应淋巴细胞中这些靶标的表达，提供了含有药物候选物的作用机制的见解。Covance的临床yaboapp体育官网前肿瘤学基团提供了一种新的搁板测定，其利用细胞因子/细胞毒性标准流式细胞术面板在T细胞，天然杀伤剂（NK）和天然杀伤T细胞（NKT）子集中量化这些终点。该技术聚焦演示了如何将细胞因子/细胞毒性™面板纳入其中体内研究和结合常规免疫蛋白酶，帮助在临床前药物开发期间建立鲁棒数据集。yaboapp体育官网

细胞因子包括干扰素γ, 肿瘤坏死因子α, IL-2通过促进肿瘤微环境中固有和适应性免疫细胞的活化和T细胞的增殖而具有抗肿瘤活性。In vivotherapies that inhibit tumor growth by way of T cell activation, through direct or indirect mechanisms, often increase the frequency of tumor-infiltrating T cells that are primed to respond vigorously to离体刺激。NK和NKT细胞在启动和随后的干扰素方面也有类似的作用γ/肿瘤坏死因子α 生产。除了细胞因子的产生，体内治疗可以诱导效应淋巴细胞以获得高度的细胞毒性特性，使肿瘤细胞溶解通过直接的细胞 - 细胞接触机构能够。该方法是由储存在免疫细胞内的细胞溶胶颗粒的穿孔素和颗粒酶的表达和释放介导的。这些毒素破坏了细胞膜并诱导靶肿瘤细胞中的细胞凋亡。此外，脱粒与效应细胞表面上CD107a的表达一致，因此可以用作细胞毒性活性的标志物。

在一起，可以分析上述签名以检查肿瘤微环境中淋巴细胞亚群的激活状态。细胞因子/细胞毒性面板通过使用T细胞，NK和NKT细胞特异性抗体组合细胞表面免疫蛋白酶对细胞因子的细胞内染色和Granzyme B表达（表1）来实现这些测量。

表1：细胞因子/细胞毒性™面板

辐射和抗MCTLA-4治疗后4T1-LUC肿瘤衍生效应细胞中细胞因子和Granzzyme B分析

细胞因子/细胞毒性小组用于测量细胞因子和颗粒酶B的效用在该数据集中使用小鼠4T1-luc乳腺癌模型得到证实。图1显示用于描绘T细胞和NK细胞亚群的门控策略。与我们所有临床前肿瘤流式细胞仪小组一样，分析从死亡细胞排除和随后的CD45描绘开始yaboapp体育官网⁺免疫细胞识别感兴趣的免疫子集（未显示）。示出了在PMA /离子霉素刺激后IFNγ，TNFα，IL-2和Granzzyme B表达的代表性谱。

4T1 luc肿瘤微环境具有高度的免疫抑制作用，其特征是存在大量粒细胞源性抑制细胞浸润（未显示）。4T1-luc是一种已知对检查点抑制疗法有抵抗力的模型。然而，当与小动物辐射研究平台（SARRP，Xstrahl）提供的辐射相结合时，抗mCTLA-4可改善4T1-luc肿瘤的肿瘤生长抑制（图2A，左图）。肿瘤生长抑制可能不是由于治疗诱导效应细胞募集增加所致，因为流式细胞术未显示任何治疗后肿瘤中T细胞或NK细胞计数增加体内处理条件与同种型对照组相比（图2A，右）。然而，离体stimulation of tumor-derived cells with PMA/ionomycin reveal that CD8⁺T细胞具有增强的产生IFNγ的能力。此外，与对照相比，NK细胞表达较高水平的颗粒酶B（图2B）。这些数据表明，用辐射和抗MCTLA-4结合治疗增强了CD8的激活状态⁺T细胞和NK细胞。这证明了在追求疗效和免疫表型的研究中包括机械性标记物的价值。

抗mCTLA-4治疗后CT26肿瘤源性效应细胞脱颗粒分析

CD107a在脱颗粒过程中在细胞表面表达，是一种常用于测量治疗诱导的细胞毒性作用的标记物。细胞因子/细胞毒性™ 采用小鼠CT26大肠癌模型，观察抗mCTLA-4对淋巴细胞毒性和肿瘤生长的影响。用抗mCTLA-4治疗的CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制率为74%（图3A）。检测CD8细胞中CD107a和颗粒酶B的表达⁺T细胞，NK和NKT细胞离体PMA/离子霉素对肿瘤细胞的刺激作用。代表性表达谱如图3B所示。分析显示，与同型对照组动物相比，抗mCTLA-4治疗触发了所有三个亚群中CD107a表达的增加。这与NK和NKT细胞中颗粒酶B表达水平下降相一致。这些数据表明，颗粒酶B存储在NK和NKT细胞在脱颗粒过程中耗尽。注意CD8⁺T细胞颗粒酶B表达在组之间没有差异，也许是因为均衡德诺维通过治疗和脱粒速率触发的颗粒酶B的表达。将这种表型均一致地与细胞毒性和直接肿瘤细胞杀灭活性的潜力诱导的治疗诱导的增强。

定制-面板配置定制细胞因子反应

细胞因子/细胞毒性™面板预先配置以测量促炎细胞因子。面板也可以定制以检查其他细胞因子响应。例如，Helper CD4⁺T细胞分为不同的CD4⁺效应表型，包括Th1，Th2和Th17。这些子集在肿瘤发病机制中具有不同的作用。TH1细胞的特征在于释放IFNγ，而TH2和TH17可以分别表征IL-4和IL-17。Cytokine / Cytotoxicity™面板可以定制，包括IL-4和IL-17A，以促进对肿瘤微环境中辅助T细胞分化的治疗诱导的影响的机械分析。

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请注意，所有的动物护理和使用都是根据AAALAC认可的设施的动物福利法规进行了IACUC议定书审查和批准。

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