药物 - 药物相互作用及转运蛋白

位于身体中许多阻隔组织中的膜药转运蛋白可以与药物相互作用以影响体内吸收,分布和消除,并且是临床相关药物 - 药物相互作用(DDIS)的原因。作为底物或转运蛋白抑制剂的鉴定可以解释临床相关的伴随药物的临床相关的曝光和毒性。

Intestinal permeability of a drug is an important factor driving the fraction absorbed and can be evaluated using the Caco-2 monolayer transport assay.

运输互动的监管考虑因素

通过FDA和EMA药物 - 药物相互作用(DDI)指南推荐这些研究,以评估转运蛋白相互作用,然后进入一中的试验。由于药物对吸收或分布的影响,转运仪研究突出了实现伴随持续施用的药物的有效血浆浓度。

Several transporters interact with drugs in clinical use. Those recommended for testing include:

  • ATP结合盒(ABC)流出转运蛋白P-甘油蛋白(P-GP),乳腺癌抗性蛋白(BCRP)和胆汁盐出口泵(BSEP)。
  • Solute carrier (SLC) uptake transporters Organic Anion Transporter (OAT) 1 and OAT3, Organic Cation Transporter (OCT) 2, Organic Anion Transporting Polypeptide (OATP) 1B1, OATP1B3, and Multidrug and Toxin Extrusion (MATE) 1 and MATE2 K.

运输互动方法:

摄取运输机测定
  • 测试系统:表达单个摄取(SLC)转运蛋白或载体对照的转染细胞系,在5%CO中的37℃下在潮湿培养箱中生长在单层中。2
  • 测定缓冲液:HBSS与HEPES,pH 7.4
  • 仅用于伴侣转运蛋白,细胞用NH预处理4.CL在细胞膜上引入pH梯度,所需的配偶摄取活性
  • Test article concentrations: 2 for substrate assays, 2 for inhibition assays
  • Radioalabeled probe substrates specific for each transporter
  • 每个运输扣的阳性对照抑制剂

培养物中的培养物的表达细胞用测定缓冲液预孵育在5%CO中的37℃下在潮湿的培养箱中预孵育30分钟2。用NH 4 Cl处理交配的细胞以在细胞膜中产生pH梯度,以促进摄取活性。将探针基板或试验制品加入三份孔中,并在适用的情况下添加抑制剂。根据转运蛋白,将平板从2-10分钟孵育一次点。缓冲剂吸出来;洗涤细胞,然后用LC-MS裂解,收集并分析测试制品的存在。

Substrate assessment: Uptake of the test article by each transporter alone or in the presence of selective inhibitor will be compared to uptake by the vector control after incubation for 2-5 minutes. Uptake of a probe substrate by each transporter alone or in the presence of selective inhibitor and by the vector control will be performed as controls.

抑制剂评估:每个转运蛋白摄取探针基材单独或在选择性抑制剂或试验制品存在下进行。通过载体控制的探针基板的摄取也将作为对照进行。如果观察到抑制,IC50.可以确定。

Efflux Transporter测定
  • 测试系统:Caco-2人肠内加管细胞,在5%CO中的37℃下在潮湿培养箱上培养在Transwell平板上221-24天
  • 测定缓冲液:HBSS含有HEPES,在顶端和基石室中的pH 7.4
  • 在测定之前测量转​​换电阻(Teer)以确认形成紧密连接的形成
  • Test article concentrations: 2 for substrate assays, 2 for inhibition assays
  • 放射性标记的渗透性标记甘露醇和咖啡因用于验证紧密的接线形成
  • Radiolabeled probe substrates are used, specific for each transporter
  • Positive control selective inhibitors for each transporter with negative inhibitor controls

测试制品和探针底物的表观渗透性在顶端至基石(A-B)中和基于Transwell平板上的顶端(B-A)方向的基础上的渗透性。在5%Co中的37℃下在37℃下在潮湿培养箱中预孵育30分钟后在5%CO2,探针或试验制品将腔室(供体)添加到相对腔室(接收器)中的空白缓冲器。然后将抑制剂加入适用的两个腔室中。将板在37℃下在5%CO中孵育2持续2个小时。收集供体和接收室样品并使用LC-MS分析测试制品的存在。然后确定测试物品渗透率和排出率。

基材评估:单独或在选择性抑制剂存在下,在两个方向上确定测试制品的运输。单独或在选择性抑制剂存在下单独或在选择性抑制剂存在下运输探针基板作为对照。

抑制剂评价:探针substra运输te will be determined in both directions after incubation for 2 hours alone or in the presence of selective inhibitor or the test article. If inhibition of efflux transport is observed, the IC50.可以确定。

囊泡膜摄取测定法
  • 试验系统:表达流出(ABC)转运仪BSEP的膜囊泡(50μg/孔)。
  • 测试制品浓度:2用于底物测定;2用于抑制测定。
  • 腺苷三磷酸(ATP) - 依赖性活性测量,用腺苷一磷酸(AMP)用作对照。
  • Radiolabeled probe substrate specific for BSEP
  • 每个运输扣的阳性对照抑制剂

表达BSEP的膜囊泡和试验制品或探针基材将在96孔板中温育。通过添加腺苷三磷酸(ATP)来引发摄取,然后在37℃下孵育30分钟。腺苷一磷酸盐(AMP)将与阴性对照并联使用。吸收将通过真空吸入终止,并用过量的冰冷的传输缓冲液漂洗两次过滤器。然后从过滤板中提取囊泡,用于LC-MS定量和计算ATP依赖性活性。

Substrate assessment: Uptake of the test article alone and with selective inhibitor in the presence of ATP will be compared to uptake in the presence of AMP. Uptake of a probe substrate by BSEP alone and in the presence of selective inhibitor will be performed as controls.

Inhibitor assessment: Uptake of a probe substrate will be conducted alone and in the presence of selective inhibitor or the test article; uptake in the presence of ATP will be compared to uptake in the presence of AMP. If inhibition of ATP-dependent uptake of the test article is observed, the IC50.可以确定。

Deliverables

这些测定将识别和谱系与膜吸毒者的衬底或抑制相互作用。数据将描述摄取和/或流出的程度,测试物品渗透性,运输障碍抑制和IC50.values as applicable.

这些数据也可用于根据可能与伴随治疗剂的可能相互作用来判断DDI风险,并有助于排名新的药物候选者。如果观察到互动,药物测量学may allow additional guidance when assessing the need for a clinical trial.