临床前研究的发展小分子抑制剂，阻止疾病相关激酶的活性继续是癌症治疗的一个主要焦点。因此，能够量化这些激酶磷酸化状态的可靠平台对于药物开发工作是有价值的。使用MV-4-11急性髓细胞白血病（AML）模型，这个更新描述了新的体外和离体在科文斯提供的磷流服务，测量磷激酶信号的一致性和可重复性。这个平台使用荧光标记的抗体，只有在特定的氨基酸残基上磷酸化才能识别蛋白质，这些氨基酸残基调节蛋白质的功能。此外，我们还展示了磷酸化流如何将高通量免疫分型与磷酸化蛋白检测相结合，这与基于ELISA和其他传统技术相比具有优势。
体内平衡和癌症发病之间的转换是由调控基因表达的细胞内信号系统的复杂网络控制的。这些分子途径是由一系列的信号蛋白组成的，这些信号蛋白驱动着各种各样的生物功能。这些包括但不限于细胞周期调控、细胞凋亡、细胞存活、血管生成、细胞迁移和免疫反应。这些通路的失调可能通过阻断宿主控制细胞增殖、肿瘤生长和/或随后的转移性疾病的能力而促进癌症的发病。1,2,3
图1中的示意图说明了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素（mTOR）途径的哺乳动物靶点的组成性激活如何促进肿瘤生长。这一途径和其他途径的激活主要由蛋白激酶控制，蛋白激酶是一种通过向丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基中添加磷酸基来开启下游蛋白质的酶。这些蛋白质的磷酸化状态通常被用作信号激活的读数。相反，细胞信号可以被去除这些磷酸基团的蛋白磷酸酶关闭。
为了证明如何利用磷流来测量蛋白质磷酸化的变化，对MV-4-11细胞进行了处理体外使用默克公司开发的pan-AKT抑制剂，MK-2206（Selleckchem；德克萨斯州休斯顿）。图2显示MK-2206在处理2和24小时后诱导MV-4-11细胞中AKT和S6的去磷酸化。用MK-2206处理也诱导细胞凋亡，这是通过caspase-3活化和annexin V结合来测量的（图3）。
MK-2206处理降低MV-4-11细胞培养中AKT和S6的磷酸化
MK-2206诱导MV-4-11细胞凋亡
为了证明磷酸化流可以产生与传统技术相似的结果，进行了western blot分析，揭示了MK-2206处理后AKT和S6去磷酸化的相似模式（图4）。
为了证明磷酸化流如何与免疫分型结合使用，给携带播散性MV-4-11肿瘤细胞的小鼠注射MK-2206或溶媒对照，并测量AKT和S6的磷酸化离体通过磷流。图5显示体内MK-2206治疗可诱导骨髓MV-4-11肿瘤细胞中AKT和S6的去磷酸化，但仅诱导小鼠淋巴细胞中AKT的去磷酸化。
体内MK-2206治疗对AKT的影响
肿瘤细胞和宿主细胞的S6磷酸化不同
以上结果表明，磷流具有多用途。研究其对细胞信号通路激活的影响，对筛选新药具有重要意义体外. 磷流也可以测量药物效应体内通过将该技术与免疫表型细胞表面标记物相结合来区分不同细胞亚群的分析。
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1磷酸化、信号传导和癌症：靶点和靶点国际生物医学研究所2015 (2015).
2作为治疗靶点的关键癌细胞信号转导途径欧洲癌症杂志42.3 (2006): 290-294.
三癌症治疗中的Akt抑制剂：从药物发现到临床应用的漫长旅程（综述）国际肿瘤学杂志48.3 (2016): 869-885.
4急性髓系白血病中Akt/PKB蛋白的结构性磷酸化：其作为预后变量的意义白血病17.5 (2003): 995-995.
5Lu，Jeng Wei，et al.“MK-2206诱导AML细胞凋亡并增强阿糖胞苷的细胞毒性。”医学肿瘤学32.7 (2015): 1-9.
