Immunohistochemistry (IHC) is a useful tool for immunophenotyping because it enables the visualization of immune system cells in context of their tissue environment. This post examines IHC in relation to other immunophenotyping tools and highlights the challenges of interspecies interpretation of IHC from毒理学病理学在早期药物或临床前发展阶段。yaboapp体育官网
免疫组织化学：一种有用的免疫分型工具
免疫表型（IP）是根据表达的不同类型的标记物或抗原来识别和表征细胞亚群的过程
- 在细胞表面，
- 在细胞质中，
- 或者在细胞核里。
IP指的是一种技术或测试，利用抗体，特别是识别不同的抗原。
有三种主要的免疫分型技术：
- IHC公司
- immunofluorescence (IF)
- 流式细胞术
IP is fundamental for the diagnosis, classification, and follow-up of hematological malignancies and immunodeficiencies, and the monitoring of immune system disorders, such as autoimmune diseases.
More recently, monoclonal antibodies (mAbs) recognizing CD molecules (CD is an abbreviation for the non-descriptive ‘cluster of differentiation’ number used to identify immune cells) have been established as invaluable tools for the treatment of cancer and autoimmune diseases.
Development and testing of such therapeutics rely on accurate knowledge of the expression and function of the target molecule.1
图1：非人灵长类扁桃体。系列章节。双IHC（左上）和IF（右上）；单IF（下图像）。
T细胞为CD3+（IHC和IF图像上为红色），B细胞为CD20+（IHC图像上为棕色，IF图像上为绿色）
免疫组织化学是三种互补的免疫分型技术之一
FC已成为白细胞悬浮在全血中，或在分离的外周血单个核细胞（PBMCs）中，或游离淋巴组织中的首选方法。然而，对于组织驻留细胞，IHC和IF是常规病理学中常用的免疫形态学方法。2-4
流式细胞术IP提供敏感的检测tigens for which antibodies may not be available for IHC/IF. However, IHC offers preservation of architecture, the ability to detect a relatively low number of cells (including neoplastic) and the evaluation of expression of some proteins, which may not be available by FC.
然而，这些技术都是相辅相成的。每种技术都提供了有关免疫系统形态的更详细信息，可用于指导其他更具体的分析，以寻找免疫功能的改变。3,5
Key features of immunophenotyping techniques
IHC和IF
常设费用
- Used for tissue-resident cells because it is performed on tissue sections and evaluated by a pathologist using a microscope
- 组织结构得以保存
- Can detect low cell numbers
- 可在常规苏木精和伊红（H&E）采集的福尔马林固定石蜡包埋样品上进行（只有在研究结束时才确定需要IP时才有优势）
- Occasionally antibodies may be available for IHC/IF that are not available for FC
- 由Covance解剖病理伞下的专业病理服务（SPS）执行
- 全血、外周血单个核细胞或游离淋巴组织的选择方法
- 使用流式细胞仪产生定量数据
- 需要新收集（样品稳定性有限）
- 有时抗体可用于不可用于IHC/IF的FC
- 由科文斯的免疫与免疫毒理学（I&I）部门执行
跨物种免疫组织化学和其他免疫表型技术应用的挑战
One of the challenges with IHC and other IP tools is that a straight read across techniques from preclinical animal studies to early development human studies may not be possible because of the differences in CD classification between species.
为了更全面地理解这一点，让我们更详细地了解CD编号和分类。
CD numbers describe the surface molecules expressed on cells
CD分子是表达在免疫系统细胞上的表面分子，在免疫细胞间的通讯和感知微环境中起着关键作用。细胞由抗原的存在（+）或不存在（-）或抗体的结合来定义。这些CD分子是鉴定和分离白细胞和淋巴细胞亚群的重要标志物。IP，包括IHC，严重依赖于由CD数抗原及其表达模式识别的细胞表面分子库。
人类CD numbers are universally adopted
人类细胞分化分子（HCDM）是一个组织，运行人类白细胞分化抗原（HLDA）研讨会，命名和表征CD分子。6
CD命名法的目的是在涉及与同一抗原结合的相同分子和抗体时提供一致性和一致性。每个抗原与一个唯一的CD号匹配。CD编号被分配给一组或一簇mab，这些mab识别在人类白细胞和其他与免疫系统相关的细胞表面表达的分子。目前（截至2020年），CD标记物的范围从CD1到CD371不等。1,6,7
The CD nomenclature has been universally adopted by the scientific community, officially approved by the International Union of Immunological Societies (IUIS) and sanctioned by the World Health Organization (WHO). Its usage has now evolved and is also commonly used to name the molecules themselves. For example, CD123 is the official name of a marker for plasmacytoid dendritic cells that has approximately six historical names: IL3R, IL3RAY, IL3RX, IL3RY, MGC34174, and hIL-3Ra. Having one name makes communication, research and reporting much more straightforward.
Beware: human CD numbers are not always relevant to animal species
然而，没有一个组织监督动物CD的数量，这使得为研究模型研究选择合适的CD标记抗体更具挑战性。
非临床研究使用几种动物物种，包括啮齿动物（小鼠、大鼠、兔子、豚鼠）、非人灵长类动物（NHPs）、狗和猪；然而，在毒性研究中，只有少数物种常规用于IP（例如小鼠、大鼠和NHPs）。如果一个分子在不同物种间高度保守，并且与人类同源性很高，那么就更有可能找到合适的抗体。
For example, CD14 is a macrophage marker widely used to detect macrophages in human tissue; yet, it is not suitable for use in animal models. In contrast, CD68 is a macrophage marker in humans, NHPs, rats, mice and dogs. However, the same CD68 antibody may not work as well in all animal species. For example, an antibody clone may work well in NHP, but not in mouse, and vice versa, yet all antibodies are named CD68.
有效使用跨物种相关和相关的IHC方法需要仔细考虑这种复杂性，并作为IHC方法开发的一部分进行彻底的测试。
交叉反应抗体并不总是可用的，因此与能够研究抗原的细胞分布并解释人类IP数据在非临床物种中的相关性的专家合作是至关重要的。
Antigens have been categorized into three groups based on corresponding antibody binding characteristics and cell distribution information:
- 抗体反应性和细胞分布与人类抗原一致的CDs。例如，许多抗人抗体（CD3、CD4、CD8、CD20、CD45等）与NHP抗原反应，NHP抗原对应于人类抗原。
- 抗体与同一抗原结合，但在不同细胞亚群中的表达在物种间不一致的CDs。例如，CD20在人类和NHPs中是标志性的B细胞分化抗原，但在大鼠中更合适的B细胞标记物是CD45A，在狗和小型猪中是CD21，而在小鼠中是CD19
- 与人类白细胞相比，非人类白细胞上出现的抗体染色非常暗淡或阴性。例如，CD19通常用于定义人类B细胞，但由于交叉反应性降低和不同的表达模式，在定义NHP B淋巴细胞时并不理想
These considerations must be taken into account when making interspecies comparisons and for markers that don’t entirely agree between species. Specific characterization of the IP for the species of interest is imperative.4
Using immunophenotyping and immunohistochemistry in toxicology studies
Basic IP of tissue cells used in toxicology studies identifies T cells, B cells, natural killer (TBNK) and myeloid cells (granulocytes and monocytes) in various species.
下表列出了一些细胞的例子，这些细胞可以通过我们全球Covance实验室的IHC通过CD标记物来确定。
| 免疫细胞（CD45*） | 物种 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| NHP | 鼠标 | 老鼠 | 猪 | Canine | 人类 | ||
| 淋巴组织 | T淋巴细胞 | CD3、CD4、CD8, CD16, CD278 | CD3、CD4、CD8 | CD3, CD8 | CD3, CD8 | CD3、CD4、CD8 | CD3、CD4、CD8 |
| B淋巴细胞 | CD19、CD20、CD21、CD79a、CD138 | CD19、CD20、CD79a、CD45R | CD79a型 | CD79a型 | CD20型 | CD20型 | |
| NK cells | CD8, CD16 | CD8 | CD8 | CD8 | CD8 | CD8 | |
| Myeloid (Macrophages, Dendritic cells, Mast cells, Granulocytes) | CD68型, CD4, CD16, CD123, CD205, CD207, CD209, CD303 | CD68、F4/80、CD4、CD117 | CD68型 | CD4 | CD68、CD66b、CD4 | ||
* Validated only in NHP
Table 1:在Covance中常用的IHC-CD标记。
除了识别上面列出的细胞类型之外，还可以执行进一步的亚型分析，例如可以解析辅助性T细胞或细胞毒性T细胞。然而，通过IHC进行分型需要复杂的多路复用，或者在连续切片上使用多种单一染色剂。
结论
免疫组织化学在肿瘤诊断中的应用毒性病理学允许识别组织切片内的细胞亚群。亚群的分化是基于这些细胞表达一种或多种独特的抗原标记物。组织的形态是保守的，允许单个细胞类型与细胞所在组织的改变相联系。与标准H&E染色相比，IHC的另一个好处是能够分离具有相似形态的细胞亚群，并量化治疗组之间的相对差异。三It also allows the visualization of structures not visible on H&E sections e.g. microglia which are a specialized population of macrophage-like cells in the central nervous system.
IHC公司is therefore a critical immunophenotyping tool that can answer a number of additional toxicological questions for drugs in development.
例如，IHC可用于：
- 确定免疫细胞的特征，并评估这些细胞与周围结构（如肿瘤）的关系
- 确定组织样本中蛋白质的特定位置，即原位蛋白质组学
- 检测细胞增殖
- 评估抗体药物的靶向或非靶向结合
- track human stem cells xenotransplanted into animal models in order to study their fate
阅读更多关于免疫组织化学服务。
References
- Kalina T, Fišer K, Pérez-Andrés M, Kuzílková D, Cuenca M, Bartol SJW, Blanco E, Engel P, van Zelm MC. CD maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Front Immunol. 2019;10:2434. doi: 10.3389/fimmu.2019.02434.
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- 人类Cell Differentiation Molecules. Available at: hcdm.org. Accessed August 2020.
- Clark G，Stocker H，Balderas R，van Zelm MC，Zola H，Hart D，Engel P.第十届人类白细胞分化抗原研讨会的CD分子命名法。临床转位免疫学。2016；5（1）：e57。内政部：10.1038/cti.2015.38。
缩写
- CD: cluster of differentiation
- 流式细胞术
- H&E: hematoxylin and eosin
- HLDA：人白细胞分化抗原
- HCDM: Human Cell Differentiation Molecules
- IF:免疫荧光
- IHC公司: immunohistochemistry
- 免疫与免疫毒理学
- 免疫表型
- 单克隆抗体：单克隆抗体
- NK: natural killer
- 非人灵长类
- 外周血单个核细胞
- SPS: Specialty Pathology Services
- 世卫组织：世界卫生组织
