OECD 229：内分泌干扰筛查程序 - 鱼短期生殖测定

執筆者：

Sarah Broadley，理科学士(荣誉)，理科硕士，PGCE，研究科学家IV，专业病理服务;Dr. Catherine Ross，英国哈罗盖特Covance Laboratories Ltd.病理科博士，医学博士，MRCVS，病理学家

日付：

2021年1月

はじめに

'内分泌破坏器是改变内分泌系统的功能的外源性物质或混合物，从而导致完整生物体或其后代或（次）群体中的不良健康影响WHO-ICPS，2002年。

内分泌干扰物筛选计划(EDSP)旨在确定一种杀虫剂、化学物质或其他物质是否会因内分泌系统的紊乱而对人类健康或环境构成风险。短期繁殖试验(试验指南229)使用黑头鲦鱼(Pimephales promelas)和日本青鳉和斑马鱼的一个端点子集进行验证。该试验将生殖适合度作为毒物作用的综合衡量，使用一套组织和生化终点，反映了与下丘脑-垂体-性腺(HPG)内分泌轴紊乱相关的影响。

规制

2018年，经合组织发布了一个修订的概念框架，用于检测和评估内分泌扰乱化学品。概念框架由五个级别的测试组成，旨在用作工具箱。

一级-根据现有信息进行排序和排序。

二级-体外分析提供机理数据。

三级-体内分析提供有关内分泌机制和作用的数据。

四级-体内分析提供了有关内分泌机制的不良影响的数据。

5级-在体内测定中，提供了内分泌和其他机制的综合数据。

鱼类短期再生测定与两栖变态测定，uterot养术测定和舍尔赫格的测定相同。

目前，在欧盟没有法定要求使用内分泌干扰的特定测试，除非要求这样做。

然而，在美国。然而，测试是强制性的，美国EPA制定了双重策略。

一级分析-在体外和体内测定中的选择。鱼短期繁殖测定和两栖动物变态测定落入这一系列测试。

二级分析-包括哺乳动物2代毒性、两栖动物生长繁殖、鸟类2代、鱼类2代和Mysid 2代。

鱼短期再生测定

材料和方法

测试需要三种测试浓度和对照。

每次处理斑马鱼时设两艘船(每艘船分别载有5只公鱼和5只母鱼)。

每次处理四艘黑头米诺鱼(由于雄性黑头米诺鱼的地盘行为，每艘船载2只公鱼和4只母鱼)。

每次治疗的四个血管或重复用来用于日本MEDAKA（每艘含有3个男性和3名女性的容器）。

评估以下参数：

分析化学 -每周水样来自坦克分析测试化学水平。

卵黄蛋白原(Vg)采用ELISA法测定该卵黄前体蛋白的含量。Vg通常只在雌鱼中表达，在雄鱼中处于休眠状态。然而，当雄性鱼暴露于内分泌干扰物时，Vg基因以剂量依赖的方式表达。因此，雄性鱼的Vg基因表达被用作暴露于雌激素性内分泌干扰物的标志。

形态学观察 -第二性征的外观和观察包括;与对照组相比，男性的颜色和脂肪垫(终止时的存在和体重)，婚礼结节测绘，每日生存和行为评估。

评估施肥成功，视觉检查胚胎，不孕症和肥沃的鸡蛋计数。

繁殖能力,对每天的鸡蛋产量进行评估。

生存，行为和外表每天观察鱼，用于死亡率和相对于控件的异常行为

观察中学特征 -此外，还观察到雄性黑头鲦鱼的婚结节和日本青鳉的乳头突起等次级特化性特征。

图1所示。图中显示雄性黑头鲦鱼的婚礼结节。使用位置模板结节的数量和大小被记录并排名为：0 - 缺席，1 - 礼物，2 - 放大和3 - 发音。

图片摘自经合组织(2012)，第229号试验:鱼类短期繁殖试验，经合组织化学品测试指南，第2节，经合组织出版，巴黎。https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

组织学制备

组织调整/处理

Fathead Minnows -将GONADS从鱼中解剖并加工整体到石蜡蜡。

日本Medaka和斑马鱼 -如果需要的话，鱼的胴体会被修整，躯干会被整个加工成石蜡。

嵌入,Gonads / Fish水平定向为它们的长轴。

切片法,穿过Gonads的中心并用Haematyxylin和eosin染色的三个步部。

組織病理学

男性 - 主要诊断标准包括：增加了Spematogonia存在的睾丸-OVA比例

增加睾丸变性

间质（Leydig）细胞增生/肥大

男性-次要诊断标准包括:

细菌苷酸的比例减少

血管或间质蛋白液增多性腺发育不同步

改变了精子细胞或精子的比例术

肉芽肿性炎症

图1所示。雄性黑头米诺鱼性腺，20倍放大倍数。条=50μm。

图2.雄性Fathead Minnow Gonad，X40放大率。Bar = 20µm。所有精子发育阶段均围绕小叶排列:(1)˚原细胞;(2) 2˚Spermatogonia;(3) 1˚精母细胞;(4) 2˚精母细胞;(5)精子。

組織病理学

女性-主要诊断标准包括:

增加卵母细胞闭锁

卵泡周围细胞增生/肥大卵黄形成减少

性腺分期的改变

女性-二级诊断标准包括:

间质纤维化

输卵管肉芽肿炎症中的卵碎片减少了排卵卵泡下降

图3。雌性黑头米诺鱼的性腺，放大倍数4倍。Bar = 200µm。两幅图中均需注意卵母细胞发育阶段:(1)核周卵母细胞;(2)皮层泡状卵母细胞;(3)早期卵黄形成的卵母细胞;(4)卵黄发生晚期的卵母细胞。

图4。雌性黑头米诺鱼的性腺，40倍放大。Bar = 20µm。