评估体外类固醇生成终点是建立你的作物保护产品的内分泌干扰物(ED)潜力的重要早期步骤。现在，世界各地的许多监管机构要求这些信息作为注册和批准过程的一部分;例如，在欧盟，最新的杀虫剂和杀菌剂指令现在要求包括有关ED潜力的信息。OECD第456号试验提供了关于化学物质对甾体生成影响的体外机制信息，这可以决定是否需要进行后续的体内研究。因此，衡量类固醇激素的可靠、灵敏和选择性的分析方法是OECD 456项目成功的先决条件。请继续阅读，了解科万斯如何通过使用高端技术平台来优化这种方法。
内分泌干扰物的潜力:关注类固醇生成
出现内分泌紊乱时与人体的内分泌系统的化学干涉产生不利影响，如发育受损或再现。在风险来自内分泌干扰的主要系统是那些涉及雌激素，雄激素，甲状腺激素和类固醇激素 - 统称为EATS方式。
类固醇激素分泌描述了生产甾体激素，雌激素样和雄激素，胆固醇。测定作物保护产品对类固醇激素的影响可以产生约三种EATS方式的信息。
对ED的评估一般基于一个概念框架，该框架将经合发组织的化验方法按照其生物学复杂性分为五个层次。1级是从现有数据中推断信息，而2级和3级涉及提供机械数据的试验——2级包括体外测定，而3级用于体内研究。4级和5级产量系统/种群水平的数据和研究往往是复杂的。在开发的早期识别ED的潜力——在经合组织概念框架的第1或第2级——是非常有益的，因为它允许你指导后续的更高层次的测试或停止对有过多ED顾虑的物质的进一步开发。
经合组织456 H295R甾体生成试验是唯一一种广泛检测甾体生成的二级体外试验——芳香化酶试验(OPPTS 890.1200）只着眼于一个特定的酶。影响生产17β雌二醇（E2）和睾酮（T）的OECD 456检测物质为ED筛选和优先顺序提供信息。
OECD 456 H295R甾体生成试验用于ED筛选和优先化的综述
经合组织TG 456 H295R甾体生成试验的目的是提供一个“是或否”的答案，关于农作物保护产品或化学物质诱导或抑制T和E2生产的潜力。结果表明，与溶剂对照相比，激素生产的相对变化。
体外H295R检测系统
共有五种不同的酶负责性类固醇激素的生物合成。H295R是表达编码这些键类固醇酶的基因的人肾上腺癌细胞系。这意味着H295R细胞系统产生在成人肾上腺皮质和性腺发现所有的类固醇激素，使其成为一个体外测试系统类固醇生成是有用的。在T和E2生产的增加和减少可被检测，并发生对类固醇激素合成的任何影响的细胞毒性独立可以区分。在限制方面，H295R细胞可产生葡萄糖 - 和mineralo，肾上腺皮质激素，使测试物质引起的在其生产的变化可能会影响T和E2的水平。另外，从对下丘脑 - 垂体 - 性腺轴效应引起的潜在ED不能从该测定确定。
OECD TG 456设计
在标准细胞培养条件下，细胞，24孔板暴露在7种浓度的测试化学物质中48小时，3个副本。同时运行两种正参比化学品(prochloraz和forskolin)。这些控制是已知的激素生产的诱导剂和抑制剂。
在暴露期结束时，使用MTT评估细胞存活率，并分析细胞培养基中的激素浓度。
使用5种精通化学品的试验进行了验证：
- Forskolin:强烈的诱导物
- 所选:强有力的抑制剂
- 阿特拉津：适度诱导
- 氨鲁米特：适度抑制剂
- 双酚A
- 弱诱导剂(E2产生)
- 弱抑制剂（T生产）
- 苯甲酰基:阴性化学物质(用于代替人类绒毛膜促性腺激素，这是一种受管制的药物，可能难以获得)。
激素浓度的测定
经合组织456试验准则没有明确规定如何应评估激素浓度;它只是强调了可用的各种方法。它规定结果应表示为相对于溶剂控制的折射率变化，并应报告最低观察效果浓度(LOEC)。如果试验结果为阴性，则应报告无观察效应浓度(NOEC)——试验的最高浓度。
OECD TG 456还规定，所使用的测试必须满足预定义的性能标准，包括T的定量限制(LOQ)为100 pg/mL, E2的定量限制(LOQ)为10 pg/mL。
常用的激素分析方法有ELISA和LC-MS。虽然ELISA对大多数常规应用是快速和敏感的，但它缺乏特异性和准确性，显示结构相似的化合物之间的交叉反应性。有许多轶事报道，ELISAs在OECD TG 456激素评估中的表现缺乏可靠性。为了加强对T和E2的分析评估，科万斯生物分析团队开发并验证了一种LC-MS/MS方法，该方法比现有的ELISA方法具有更高的灵敏度、选择性和可靠性。与体外评估团队合作，提供了专门的，灵活的能力运行强大的OECD TG 456分析。
LC-MS/MS分析方法用于OECD TG 456 H295R激素生成试验的激素评估
开发LC-MS/MS方法学有多个目标:
- 开发一种对T和E2的高灵敏度和选择性分析，可以测量到非常低的浓度水平-超过OECD TG 456的要求
- 验证通过展示的方法：
- 具有精确、准确、选择性强、可靠的特点
- 支持OECD TG 456的要求是合适的
LC-MS / MS生物分析激素测试开发
实验采用API4500质谱仪进行，并对方法进行优化，得到的参数如表1所示。
为了进一步推低LLOQ雌二醇(5.00 pg / mL)支持雌二醇水平的差异,差别在对这些我们利用一个API 6500 + SelexION质谱仪,它有一个微分流动分离(DMS)的设备提供了一个额外层次的选择性减少基体效应,实现更高的选择性和灵敏度的信心。
对于T和E2的LC-MS / MS生物分析方法的验证支持OECD TG 456
LC-MS/MS方法学验证的第一部分重点对LC-MS/MS方法学进行了精密度、准确性、选择性、线性度和样品存储稳定性的验证。
根据OECD TG 456的要求，该测试还使用了已知的六种化学物质来诱导和抑制激素的产生先前。采用经验证的LC-MS/MS方法分析OECD TG 456 H295R生成的样品，所有OECD TG 456要求均满足。
LC-MS/MS激素分析方法在OECD TG 456中的应用和好处
这种生物分析方法现在是OECD TG 456的标准做法对所有作物保护产品和化学品在科文斯。该测试是可靠，准确，灵敏的和选择性的，它们是在不同的ELISA分析的优点。它也不会从很长的时间受到影响，批与批之间的变化或者是常见的这类免疫测定试剂可访问性问题。这LC-MS / MS激素分析方法对OECD TG 456还得益于通过密切合作与体外安全评估小组的工作bioanalysts的一个专门的团队来执行。这个联合起来，合作的方式优化的结果为你的学习 - 因为从这个体外研究结果将指导后续的昂贵的高层次的研究，你需要的数据是可靠的，可靠的和及时的。
结论
本LC-MS/MS验证方法用于测定低浓度的甾体激素T和E2是准确、灵敏和选择性的。它提供了作物生产产品对甾体生成影响的重要信息，而不需要依赖特殊试剂和试剂盒的可用性。此外，总分析时间越短，意味着你能更快地获得这一重要的体外机理数据，因此你可以更快地确定是否需要随后的ED电位体内测试。
参考文献
OECD指南化学品456 H295R类固醇检测的测试。2011。
缩写
E2: 17β雌二醇
EATS：雌激素，雄激素，甲状腺激素和类固醇
艾德:内分泌干扰物)
ELISA:酶联免疫吸附试验
LC-MS / MS：液相色谱法 - 质谱
定量下限:定量的下限
定量限:定量的限制
麻省理工:3 -(4、5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子
OECD：在经济合作与发展组织
T:睾酮
TG:测试指南
